DNA恒溫快速擴增試劑盒（熒光型）使用說明書
【產品名稱】
DNA恒溫快速擴增試劑盒（熒光型）
【原理概述】
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術：在常溫恒溫條件下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板，在侵入位點形成D-loop區域，并開始對DNA雙鏈進行掃描；待找到與引物互補的目的區域后，復合體Rec/ssDNA解體的同時，聚合酶也結合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。本試劑盒在39 oC下，依賴核酸外切酶的作用，加入根據模版設計的特異的分子探針，使用熒光監測設備能實現對目標片段擴增過程的實時監控。
【產品特點】
本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應時間短（僅需20 mins）等優點，反應組分為干粉狀態，操作簡便，易于保存。
可適用于各種品牌的熒光定量PCR儀、恒溫熒光擴增儀器等熒光檢測設備。
【引物設計】
建議使用長度在30-35 bp的引物，引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度；引物設計避免形成二級結構而影響擴增；擴增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。
【熒光探針設計】
探針序列不與特異性引物識別位點重疊，長度為46-52 nt，序列避免回文序列、內部二級結構和連續的重復堿基。探針共有四個修飾位點：距離5’端的≥35 nt的中部位置標記一個dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點；THF位點的上游標記一個熒光基團，下游標記一個粹滅基團，兩個基團的間距為2-4 nt；THF距離3’末端≥15 nt，并且3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer。
【試劑盒組成】
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組成 |
含量 |
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A buffer |
800 μL×1管 |
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B buffer |
150 μL×1管 |
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正對照模板 |
30 μL×1管 |
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正對照引物探針Mix |
35 μL×1管 |
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試劑 |
48份 |
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使用說明書 |
1份 |
【試劑盒儲存】
運輸條件：低溫運輸；
儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 oC，避光保存，避免重壓、反復凍融；
產品有效期：12個月。
【操作步驟】
1. 提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。
2. 每個干粉反應管加入10 μL A buffer（注意：A buffer需完全融化混勻，否則會對實驗效果產生影響）；
3. 每個反應管分別加入1 μL上游引物、1 μL下游引物和0.4 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對于多個反應、步驟2和步驟3可以混合后再分裝至反應管中）；
4. 向反應管中依次加入3.6 μL ddH2O和2 μL核酸模板（可根據核酸濃度調整加入的核酸模板體積，并相應調整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為5.6 μL）；
5. 最后向反應管中加入2 μL B buffer并充分混合（對于多個反應，建議將B buffer加至反應管的蓋子內側，上下顛倒反應管8-10次混勻）；
6. 混勻后，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應管放入熒光檢測設備中。熒光檢測程序設置為：恒溫39 oC；每30 s采集一次FAM通道（信號采集通道的選擇與熒光探針設計一致）熒光值；反應時間20 mins。
注：如使用ABI系列PCR儀，請務必于passive reference和quencher處均選擇“none”。
*正對照反應單元體系配制：正對照模板加入2μL，引物與探針加入2.4 μL正對照引物探針Mix（已包含探針和上/下游引物），其他組分參照體系配制。
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N：陰性對照； P：正對照 |
1． 由于試劑盒靈敏度非常高，在進行反應時請注意避免微量核酸污染，并盡量考慮設置空白對照以確認是否有核酸污染。
2． 試劑盒保質期12個月。每次使用時，請取出實驗所需的MIRA反應單元的數量，置于冰浴條件下并在8小時內使用；剩余部分，請置于存儲條件下。
相關產品：
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產品名稱 |
貨號 |
規格 |
目錄價格 |
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DNA恒溫快速擴增試劑盒（基礎型） |
WLB8201KIT |
48份/盒 |
2400 |
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48份/盒 |
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2500 |
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HybriDetect試紙條 |
WLFS8201 |
50條/包 |
1650 |
